Национальные институты здравоохранения и другие агентства финансируют высокопроизводительные эксперименты по геномике и транскриптомике («омикс»), которые в быстро растущем масштабе размещают цифровые образцы данных в открытом доступе.^1,2 Важность этих цифровых образцов данных дополнительно иллюстрируется растущим числом связанных рецензируемых публикаций, демонстрирующих их научную ценность.^3,4 Исследования раковых стволовых клеток (РСК) — многообещающее направление исследований, которое приводит к получению больших объемов уникальных данных. Появляется все больше доказательств того, что ОСК вызывают терапевтическую резистентность, рецидив опухоли и метастазирование. Известно, что эти клетки обладают стволовыми свойствами/функциями и представляют собой критическое подмножество в опухолевой массе, ответственное за сохранение опухоли даже у пациентов после терапии. ОСК обладают сходными свойствами с нормальными стволовыми клетками, включая способность к самообновлению и дифференцировке, что приводит к возникновению гетерогенных раковых клеток, составляющих основную часть опухоли.⁵

В последнее время была проделана большая работа по идентификации специфических клеточных маркеров и профилей экспрессии генов, которые можно использовать для идентификации и различения CSC, но до сих пор не совсем понятно, как CSC сравниваются с естественными клетками-предшественниками.⁵ Ранее было показано, что существует несколько факторов транскрипции, которые в настоящее время известны как экспрессируемые в нормальных стволовых клетках. Многие из этих факторов были обнаружены при множественных раковых заболеваниях человека.⁶ Кроме того, факторы стволовости являются важной медицинской мишенью для лечения рака.⁷ Мы расширили этот вопрос о важности факторов стволовости для CSC, предприняв повторный анализ общедоступных наборов данных одноклеточной РНК-seq, которые характеризуют образцы первичного рака печени.⁸ образцы здоровой печени плода и взрослого человека.⁹ Важность исследования основана на том факте, что рак печени занимает шестое место среди самых смертоносных видов рака в мире.¹⁰ Используя этот экономически эффективный общедоступный источник данных, мы сравнили уровни экспрессии маркеров и факторов дифференцировки стволовости в различных типах клеток, присутствующих в этих образцах печени, чтобы выявить сходство между CSC печени, плюрипотентными стволовыми клетками печени (гепатобилиарными гибридными клетками-предшественниками) и клетками-предшественниками печени. . Образцы набора данных рака печени содержат как гепатоцеллюлярную карциному (HCC), так и внутрипеченочную холангиокарциному (ICC). Было показано, что CSCs являются важными факторами в развитии обоих видов рака.¹¹ Кроме того, поскольку печень содержит бипотенциальные клетки-предшественники, которые потенциально могут развиваться как в HCC, так и в ICC,¹² представляет большой интерес понять сходства и различия в экспрессии между этими эмбриональными предшественниками и CSCs.

Мы сосредоточились на экспрессии 34 известных транскрипционных факторов и клеточных маркеров стволовости.^13,14 чтобы лучше понять классификацию злокачественных клеток CSC и дополнительно определить ключевые факторы CSC печени. Затем мы сравнили более широкую экспрессию генов, чтобы идентифицировать потенциальные новые факторы стволовости. Здесь мы показали, что ОСК печени демонстрируют более высокие уровни экспрессии специфических маркеров дифференцировки (SOX9, KRT19, KRT7 и CD24) и факторов Яманаки.¹⁵ (SOX2 и Oct4) по отношению к уровням экспрессии в фетальных и взрослых типах клеток-предшественников, что позволяет предположить, что они потенциально объясняют потенциал дифференцировки CSCs. Мы также идентифицировали CXCL10 как потенциальный маркер CSC. Расширение наших знаний о свойствах CSC с использованием общедоступных репозиториев данных может привести к новым терапевтическим путям для лечения рака, нацеленного на CSC.

Материалы и методы

Данные экспрессии рака печени⁸ и плодная и взрослая здоровая печень⁹ исследования были получены из Омнибуса экспрессии генов NCBI (GEO)¹⁶ репозиторий. GEO — это общедоступное хранилище данных функциональной геномики, в котором используются стандарты данных MIAME (минимальная информация об эксперименте с микрочипом) и MINSEQE (минимальная информация об эксперименте по секвенированию следующего поколения). Это гарантирует, что сохраненные данные будут правильно отформатированы, чтобы способствовать обмену данными и повторному анализу для дальнейшего обнаружения знаний. Данные, хранящиеся в GEO, включают как необработанные данные в формате FASTQ, так и окончательно обработанные (нормализованные) данные в виде матриц подсчета данных об экспрессии генов, что позволяет проводить повторный анализ из нескольких начальных точек, обеспечивая как точность предыдущих результатов, так и скорость анализа данных. . Для нашего исследования повторного анализа мы начали с матриц подсчета данных об экспрессии генов для двух исследований. Это решение было основано на недоступности необработанных данных исследования рака печени, которое находится под ограничением из базы данных генотипов и фенотипов (dbGaP).¹⁷Однако, учитывая сходство подходов к секвенированию, сборке и вызову генов в исследованиях, мы не ожидали, что какие-либо систематические проблемы в профилях экспрессии генов возникнут из-за использования матриц подсчета данных экспрессии генов, которые нельзя было бы объяснить с помощью строгой нормализации. что сделало бы наши результаты качественно отличными от повторного анализа, начинающегося с необработанных данных.

Исследование рака печени состоит из 9946 профилей одноклеточной РНК-seq от 19 пациентов, в общей сложности более 56 миллионов прочтений и 4,2 миллиарда пар оснований (GSE125449).⁸ Исследование печени плода и взрослого человека состоит из 1467 профилей одноклеточной РНК-seq, всего 283 миллиона прочтений и 21 миллиард пар оснований (GSE130473).⁹ Чтобы учесть влияние образцов с низким покрытием, генов с низким покрытием и различий в считываниях для образца с одной ячейкой, мы выполнили строгие этапы фильтрации и нормализации для учета эффектов, специфичных для образца. Чтобы отфильтровать образцы с низким охватом, образцы с общим числом прочтений менее 1000 были исключены из дальнейшего анализа. В результате для анализа дифференциальной экспрессии было представлено 9505 образцов рака печени и 1260 образцов здоровой печени.

Кроме того, были исключены гены с 0 прочтений во всех образцах, в результате чего в анализ был включен окончательный набор из 42 684 генов. В дополнение к генам, кодирующим белок, набор генов включает псевдогены и днРНК.

Нормализация и дифференциальный анализ экспрессии были выполнены с помощью программы edgeR.¹⁸ Пакет R, используя стандартную методологию. Во-первых, размеры библиотек были нормализованы путем нахождения коэффициентов масштабирования для размеров библиотек, которые минимизируют логарифмические изменения между образцами. Это было сделано с использованием усеченного среднего значения M (TMM) между каждой парой образцов.¹⁹ для расчета коэффициента масштабирования эффективного размера библиотеки. Затем для оценки дисперсии был использован метод вероятности Кокса-Рейда с поправкой на профиль (CR) путем подгонки обобщенных линейных моделей (GLM) к матрице плана.²⁰ Рассчитывали общую дисперсию для всех генов, трендовую дисперсию в зависимости от обилия генов и индивидуальную дисперсию генов. После подгонки отрицательного биномиального GLM для каждого гена дифференциальную экспрессию оценивали с использованием F-критерия квазиправдоподобия.²¹который учитывает неопределенность в оценке дисперсии для каждого гена и, как следствие, обеспечивает более надежный и надежный контроль частоты ошибок. Чтобы учесть различия в обнаружении мРНК между двумя наборами данных, мы внедрили коррекцию пакетного эффекта в анализ дифференциальной экспрессии. Тип исследования был включен в матрицу дизайна в качестве дополнительной переменной. Частота ложных открытий дополнительно контролировалась с помощью коррекции множественного тестирования Бонферрони.

Анализ онтологии генов был выполнен с использованием DAVID 6.8.²² Функциональный инструмент аннотации. Коррекция множественного тестирования Бенджамини была применена к p-значениям из результатов анализа GO. Анализ обогащения был выполнен по трем подонтологиям: биологический процесс, молекулярная функция и клеточный компонент. В качестве фонового набора генов использовали полный набор генов Homo sapiens.

Кластеризация всех 10 865 одноклеточных образцов была выполнена с использованием анализа t-распределенного стохастического встраивания соседей (t-SNE). Отфильтрованные данные количества генов были нормализованы с использованием подхода EdgeR, а log2 преобразован в количество на миллион (CPM), чтобы учесть различия в количестве прочтений между образцами без изменения генного состава образцов, что позволяет проводить более точное сравнение между образцами. Анализ t-SNE был выполнен с использованием пакета Python Scikit-learn.²³ Данные визуализировались в двух измерениях встроенного пространства. Значение недоумения, связанное с количеством ближайших соседей, было установлено равным 30, чтобы учесть большой размер набора данных. Мы использовали 300 итераций оптимизации для уточнения кластерного анализа. Коэффициент раннего преувеличения, контролирующий, насколько тесными являются естественные кластеры во встроенном пространстве, был сохранен на значении по умолчанию 12,0. Точно так же скорость обучения была сохранена на значении по умолчанию 200,0. Результирующее встроенное пространство было построено с использованием библиотеки matplotlib.²⁴ и морской²⁵ python в виде точечной диаграммы с использованием парной цветовой палитры.

Коробчатая диаграмма и графики скрипки были сгенерированы с использованием ggplots2,²⁶ со значениями цены за тысячу показов log2.

Полученные результаты

Использование ранее опубликованных данных одноклеточной РНК-секвенции для рака печени⁸ и плодная и взрослая здоровая печень,⁹ мы повторно проанализировали 10 865 образцов по 42 684 генам. Этот комбинированный набор данных представляет собой библиотеку секвенирования из более чем 25,2 миллиарда пар оснований. Учитывая, что данные из двух экспериментов были секвенированы и собраны с использованием несколько разных платформ и программ, мы выполнили строгие этапы фильтрации и нормализации, чтобы гарантировать, что профили экспрессии генов были напрямую сопоставимы во всех исследованиях. Этот шаг включал фильтрацию клеток с менее чем 1000 прочтений, генов с нулевыми прочтениями во всех образцах. Затем мы выполнили коэффициенты нормализации размера библиотеки и рассчитали общую дисперсию для всех генов, трендовую дисперсию в зависимости от обилия генов и дисперсию отдельных генов с использованием алгоритма edgeR.¹⁸ пакет Р. Поскольку подготовка библиотеки кДНК выполнялась с использованием двух разных подходов, 10x Genomics Single Cell 3ʹ для Ma et al.⁸по сравнению с SmartSeq2 для Segal et al,⁹ мы сначала подтвердили правильность нашего подхода к нормализации на наборе генов домашнего хозяйства.²⁷ Наш анализ экспрессии набора генов, используемых в качестве эталонов в исследованиях экспрессии генов, не показал существенных различий в экспрессии между раком печени.⁸ и плодная и взрослая здоровая печень⁹ наборы данных (фигура 1). Из 7 генов домашнего хозяйства, исследованных для подтверждения нормализации экспрессии (MB, FAM96B, NDUFB4, NOP10, SNRPD2, RPSA, RPLP0), SNRPD2 показал наибольшую кратную разницу с 0,20-кратным повышением экспрессии в наборе данных Ma et al. Эти результаты подтвердили правильность наших подходов к нормализации, подчеркнув сходство уровней экспрессии в исследованиях, учитывая возможность различий в экспрессии, вызванных различиями в методологии подготовки библиотеки.

фигура 1 Сравнение экспрессии генов домашнего хозяйства MB, FAM96B, NDUFB4, NOP10, SNRPD2, RPSA, RPLP0 между Ma и соавт.8 и Сигал и др.9

Чтобы еще больше повысить уверенность в наших результатах нормализации, мы провели анализ tSNE необработанных данных подсчета из обоих исследований по сравнению с нормализованными, преобразованными в log 2 значениями CPM. Цифра необработанного подсчета tSNE продемонстрировала четкое разделение между образцами из Ma et al и Segal et al, что потенциально связано с различиями в подготовке библиотеки кДНК (фигура 2). Однако, следуя нашему подходу к нормализации, график t-SNE показал гораздо большее перемешивание образцов Ma et al и Segal et al (Рисунок 3). Это указывает на кластеризацию образцов на основе их профилей экспрессии генов и, соответственно, их профилей типов клеток. Учитывая смешение образцов, мы были уверены, что анализ дифференциальной экспрессии будет отражать реальные различия между типами клеток.

фигура 2 Анализ t-SNE необработанных подсчетов образцов рака печени и одноклеточной РНК-секвенции печени плода/взрослого человека, окрашенных в результате исследования.

Рисунок 3 Анализ t-SNE нормализованных значений log2 CPM из образцов РНК-seq рака печени и одноклеточной печени плода / взрослого человека, окрашенных в результате исследования.

После нормализации наша первая цель состояла в том, чтобы идентифицировать изменения экспрессии, ответственные за плюрипотентность в злокачественных клетках, и оценить уместность их классификации как CSC. Для достижения этой цели мы сравнили экспрессию CSC печени (злокачественных клеток) и фетальных типов клеток-предшественников (CD235a-/CD45-/EpCAM+/NCAM+ FETAL) с дифференцированными клеточными типами взрослых и плода (Рисунок 4). Этот контрольный набор включал нормальные взрослые дифференцированные клетки печени (CD235a-/EpCAM-/ASOPR1+ ADULT и CD235a-/EpCAM+ ADULT), эмбриональные дифференцированные клетки печени (CD235a-/CD45+/EpCAM-FETAL, T-клетки, B-клетки), ассоциированные с раком фибробласты (CAF), ассоциированные с опухолью макрофаги (TAM) и ассоциированные с опухолью эндотелиальные клетки (TEC). Мы обнаружили, что 76 генов были значительно активизированы по сравнению с нормальными дифференцированными клетками печени (> 5-кратная сверхэкспрессия и скорректированное Бонферрони p-значение <0,001) (Дополнительная таблица 1). Затем мы сосредоточились на 34 известных маркерах стволовости, важных для фенотипа CSC (Дополнительная таблица 2).^13,14 Этот набор включал маркеры клеточной поверхности, а также факторы транскрипции, в том числе факторы Яманаки.¹⁵ Среди активированных генов в качестве маркеров стволовых клеток участвуют следующие гены: SOX9, KRT19, KRT7 и CD24. Эти результаты подтверждают утверждение о том, что стволовые клетки рака печени имитируют профили экспрессии фетальных гепатобилиарных клеток-предшественников, а также правильную классификацию этих клеток как РСК.

Рисунок 4 Анализ t-SNE нормализованных значений экспрессии log2 CPM для образцов РНК-seq рака печени и одноклеточной печени плода / взрослого человека, окрашенных по классификации типов клеток.

Потенциальный интерес представляет тот факт, что когда мы рассмотрели сверхэкспрессированные гены в целом, мы обнаружили, что они значительно обогащены генами внеклеточного матрикса (GO:0031012, p-значение = 4,3E-9), учитывая важность внеклеточного матрикса в модуляции пролиферации. стволовых клеток²⁸ и продвижение обновления CSC.²⁹ И наоборот, только два гена показали значительную (> 5-кратную) недостаточную экспрессию среди CSC печени и эмбриональных предшественников: серглицин и антиген гистосовместимости HLA класса II, альфа-цепь DR (HLA-DRA). Учитывая, что HLA-DRA экспрессируется в зрелых иммунных клетках, которые составляют большую часть нашего контрольного набора типов клеток, этот результат дает нам уверенность в том, что наш набор CSC печени и типы клеток-предшественников плода сформировали отличный недифференцированный набор от нашего дифференцированного контроля. набор типов ячеек.

Чтобы дополнительно подтвердить наши результаты, мы затем включили подмножество взрослых клеток, экспрессирующих маркеры клеток-предшественников печени (подобных HPC), с CSC печени и типами клеток-предшественников плода. Мы обнаружили, что 46 генов были значительно сверхэкспрессированы (> 5-кратная сверхэкспрессия и значение p с поправкой Бонферрони <0,001) в этом наборе по сравнению с контрольными типами клеток (Дополнительная таблица 3). Подтверждая наши предыдущие результаты, мы снова обнаружили, что маркеры стволовости SOX9, KRT19, KRT7 и CD24 были сверхэкспрессированы в этом наборе.

Наконец, мы проанализировали различия в экспрессии между CSC печени и типами клеток-предшественников плода. Мы обнаружили, что 248 генов были как минимум в 5 раз сверхэкспрессированы в CSCs печени (значение p <0,001) (Дополнительная таблица 4). Интересно, что CSC печени имели значительное обогащение сверхэкспрессированными генами, функционирующими в SRP-зависимом котрансляционном белке, направленном на мембрану (GO: 0006614, значение p = 5,5E-14), структурный компонент рибосомы (GO: 0003735, значение p = 4,0). E-12) и инициация трансляции (GO:0006413, p-значение = 1,9E-11). Это потенциально говорит о нарушении регуляции трансляции при раке и повышенной скорости роста ОСК по сравнению с клетками-предшественниками плода. Интересно, что 2 фактора Яманаки¹⁵ были значительно сверхэкспрессированы в ОСК печени по сравнению с клетками-предшественниками плода: Oct4/POU5F1 (в 2,14 раза, p-значение = 8,28E-48) и SOX2 (в 1,13 раза, p-значение = 0,0392) (Рисунок 5). Кроме того, CSC печени имели значительно более высокую экспрессию 3 дополнительных факторов стволовости: CD44 (в 3,25 раза, p-значение = 4,24E-21), KRT7 (в 2,2 раза, p-значение = 1,27E-15) и SOX9 (в 1,71 раза, p-значение). p-значение = 1,08E-7). Продолжая поддерживать важность CD44 в развитии и прогрессировании рака,³⁰ CD44 также был значительно сверхэкспрессирован в CSC печени по сравнению с HPC-подобными (в 2,45 раза, значение p = 7,01E-29).

Рисунок 5 Коробчатые диаграммы экспрессии факторов стволовости (OCT4, SOX2, CD44, KRT7, SOX9), которые отличают CSC печени от типов клеток-предшественников плода.Заметки: *р-значение <0,05; ***р-значение <0,0001.

Чтобы дополнительно отделить клетки злокачественного рака печени от CSC печени, мы провели анализ t-SNE, используя все 10 865 образцов клеток по всем 42 684 генам. Злокачественные клетки демонстрировали в основном отчетливую кластеризацию отдельно от других типов клеток, повторяя ранее наблюдаемые результаты Ma et al.⁸ Однако особый интерес представлял большой кластер, который содержал большинство HPC-подобных клеток (526/988), а также небольшое подмножество злокачественных клеток (155/1990). Учитывая общее сходство в экспрессии между этими злокачественными клетками и HPC-подобными клетками, можно предположить, что они могут быть более точным определением CSC печени. Хотя существенных различий между этими двумя группами не наблюдалось, CSC в этом кластере имели более низкие уровни CXCL10, чем HPC-подобные клетки (в 0,749 раза, значение p = 0,145). Это снижение экспрессии может потенциально способствовать пролиферации CSC, учитывая противоопухолевую активность CXCL10.³¹

Обсуждение

Благодаря разнообразию исследований рака, которые в настоящее время проводятся с помощью секвенирования одноклеточных клеток нового поколения, обилие данных позволяет нам начать задавать дополнительные вопросы, выходящие за рамки первоначального круга исследователей. Профили клеточной экспрессии являются важными инструментами для понимания трансформации нераковых клеток в раковые и понимания стволовости CSC. Использование больших наборов данных имеет решающее значение для таких типов анализа. Это исследование основано на предыдущих исследованиях и расширяет ранее установленные методы метаанализа экспрессии генов для работы с еще большими наборами данных.³² Это позволяет нам выйти на новый уровень в масштабах нашего сравнительного анализа, чтобы генерировать открытия новых знаний. В частности, мы стремились понять, как профили экспрессии CSC сравниваются со взрослыми и фетальными клетками-предшественниками, чтобы лучше понять возможности самообновления и дифференцировки CSC. Для достижения нашей цели мы провели повторный анализ двух общедоступных наборов данных одноклеточной РНК-seq, которые характеризуют рак печени и образцы здоровой печени взрослого человека и плода.

Сначала мы изучили профили экспрессии 34 известных маркеров стволовости.^13,14 для обеспечения точности предыдущей характеристики клеток как CSCs. Изучая экспрессию набора факторов стволовости в различных типах клеток раковых и здоровых образцов печени взрослых и плода, мы заметили, что ОСК попадают в отдельный профиль экспрессии, который намного больше похож на профиль клеток-предшественников, в отличие от терминально дифференцированных клеток. типы клеток. В частности, мы наблюдали значительно более высокую экспрессию маркеров стволовых клеток SOX9, KRT19, KRT7 и CD24 в CSC по сравнению с терминально дифференцированными типами клеток. Кроме того, CSC имели значительно более высокие уровни экспрессии Oct4 и SOX2, чем типы клеток-предшественников. Исходя из этого, мы предполагаем важность этих двух факторов Яманаки.¹⁵ в продвижении самообновления и дифференциации возможностей CSC.

Наши результаты также выявили значительное обогащение терминов GO, SRP-зависимого котрансляционного белка, нацеленного на мембрану, структурного компонента рибосомы и инициации трансляции в CSC печени по сравнению с гепатобилиарными гибридными предшественниками. Интересно, что все три термина GO функционируют при увеличении продукции белков, особенно тех, которые нацелены на мембраны. Недавние исследования ранее показали важность SRP-зависимого котрансляционного белка, направленного на мембрану при раке легкого.³³ Кроме того, было показано, что белки, принадлежащие к этим категориям GO, активируют рост опухоли и метастазирование в клетках рака молочной железы.³⁴ Эти результаты дополнительно иллюстрируют сходство в экспрессии генов при разных типах рака и открывают дополнительные потенциальные возможности для новых методов лечения рака печени, поскольку ингибиторы транслокации белков через мембраны недавно были задействованы в качестве противоопухолевых агентов.³⁵

Эти результаты дают новое представление о биологии рака, которое стало возможным благодаря гармоничному использованию общедоступных наборов данных. Хотя многие из факторов стволовости ранее были определены как важные при раке, наши результаты дают уникальное представление о том, как стволовые клетки рака отличаются по экспрессии от типов клеток-предшественников печени. Мы считаем, что это обеспечивает лучшее понимание того, как эти маркеры функционируют, обеспечивая повышенный потенциал пролиферации и дифференцировки, наблюдаемый в раковых стволовых клетках. В частности, в то время как CD44 и SOX9 ранее были вовлечены в стимулирование пролиферации раковых стволовых клеток,³⁶ мы считаем, что наша работа является первой, в которой KRT7 участвует в пролиферации стволовых клеток рака печени. Наше исследование демонстрирует потенциальные возможности использования общих больших объемов данных для открытия новых знаний и выработки гипотез.

Благодарности

Эта работа частично финансировалась за счет гранта NIH UL1TR001433.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

использованная литература

1. Bourne PE, Bonazzi V, Dunn M, et al. Инициатива NIH «От больших данных к знаниям» (BD2K). J Am Med Inform Assoc. 2015;22(6):1114. дои: 10.1093/джамия/ocv136

2. Патен Б., Дикханс М., Друкер Б.Дж. и соавт. Центр больших данных трансляционной геномики NIH BD2K. J Am Med Inform Assoc. 2015;22(6):1143–1147. дои: 10.1093/джамия/ocv047

3. Тога А.В., Фостер И., Кессельман С. и др. Большие биомедицинские данные как ключевой ресурс науки открытий. J Am Med Inform Assoc. 2015;22(6):1126–1131. Дои: 10.1093/джамия/ocv077

4. Ягодник К.М., Коплев С., Дженкинс С.Л. и соавт. Разработка структуры для цифровых объектов в общем достоянии «Большие данные к знаниям» (BD2K): отчет о пилотном семинаре Commons Framework. Джей Биомед Информ. 2017;71:49–57. дои: 10.1016/j.jbi.2017.05.006

5. Batlle E, Clevers H. Новый взгляд на стволовые клетки рака. Нат Мед. 2017;23(10):1124–1134. дои: 10.1038/nm.4409

6. Бек Б., Бланпейн С. Раскрывая потенциал раковых стволовых клеток. Нат Рев Рак. 2013;13(10):727–738. дои: 10.1038/nrc3597

7. Ян Л., Ши П., Чжао Г. и др. Нацеливание на пути раковых стволовых клеток для лечения рака. Сигнал Преобразование Цели Ther. 2020;5(1):8.

8. Ма Л., Эрнандес М.О., Чжао Ю. и др. Биоразнообразие опухолевых клеток приводит к перепрограммированию микросреды при раке печени. Раковая клетка. 2019;36(4):418–430.e416. doi: 10.1016/j.ccell.2019.08.007

9. Сигал Дж.М., Кент Д., Веше Д.Дж. и др. Анализ отдельных клеток печени плода человека фиксирует транскрипционный профиль гепатобилиарных гибридных предшественников. Нац Коммуна. 2019;10(1):3350. дои: 10.1038/s41467-019-11266-x

10. МАИР. Информационные бюллетени по населению-globocan-IARC; 2019. Доступно с: http://gco.iarc.fr/today/fact-sheets-cancers. По состоянию на 19 августа 2020 г.

11. Кумар М., Чжао X, Ван XW. Молекулярный канцерогенез гепатоцеллюлярной карциномы и внутрипеченочной холангиокарциномы: на шаг ближе к персонализированной медицине? Клеточная Биология. 2011;1(1):5. дои: 10.1186/2045-3701-1-5

12. Wu PC, Lai VC, Fang JW, Gerber MA, Lai CL, Lau JY. Гепатоцеллюлярная карцинома, экспрессирующая как гепатоцеллюлярные, так и билиарные маркеры, также экспрессирует цитокератин 14, маркер бипотенциальных клеток-предшественников. Дж Гепатол. 1999;31(5):965–966.

13. Zhao W, Li Y, Zhang X. Маркеры, связанные со стволовостью, при раке. Рак Трансл Мед. 2017;3(3):87–95. дои: 10.4103/ctm.ctm_69_16

14. Пурам С.В., Тирош И., Парих А.С. и др. Одноклеточный транскриптомный анализ первичных и метастатических опухолевых экосистем при раке головы и шеи. Клетка. 2017;171(7):1611–1624.e1624. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.044

15. Лю С., Хуан Дж., Чен Т. и др. Факторы Yamanaka критически регулируют сигнальную сеть развития в эмбриональных стволовых клетках мышей. Сотовые Res. 2008;18(12):1177–1189. doi: 10.1038 / cr.2008.309

16. Эдгар Р., Барретт Т. Стандарты и услуги NCBI GEO для данных микрочипов. Нат Биотехнолог. 2006;24(12):1471–1472. дои: 10.1038/nbt1206-1471

17. Трика К.А., Хао Л., Стурке А. и соавт. База данных генотипов и фенотипов NCBI: dbGaP. Нуклеиновые Кислоты Res. 2014;42(D1):D975–979. дои: 10.1093/нар/gkt1211

18. Робинсон, доктор медицины, Маккарти ди-джей, Смит Г.К. edgeR: пакет Bioconductor для анализа дифференциальной экспрессии цифровых данных экспрессии генов. Биоинформатика. 2010;26(1):139–140. doi: 10.1093/биоинформатика/btp616

19. Робинсон М.Д., Ошлак А. Метод нормализации масштабирования для анализа дифференциальной экспрессии данных секвенирования РНК. Геном Биол. 2010;11(3):R25. doi: 10.1186/gb-2010-11-3-r25

20. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Дифференциальный анализ экспрессии многофакторных экспериментов RNA-Seq в отношении биологической изменчивости. Нуклеиновые Кислоты Res. 2012;40(10):4288–4297. дои: 10.1093/нар/gks042

21. Лун А.Т., Чен Ю., Смит Г.К. Это DE-licious: рецепт для дифференциального анализа экспрессии экспериментов RNA-seq с использованием методов квазиправдоподобия в edgeR. Методы Мол Биол. 2016;1418:391–416.

22. Хуанг да В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Систематический и комплексный анализ больших списков генов с использованием ресурсов биоинформатики DAVID. Нат Проток. 2009;4(1):44–57. doi: 10.1038/nprot.2008.211

23. Педрегоса Ф., Вароко Г., Грамфорт А. и др. Scikit-learn: машинное обучение на Python. J Mach Узнать Res. 2012;12:2825–2830.

24. Хантер Джей Ди. Matplotlib: среда 2D-графики. Информатика Инженер. 2007;9(3):90–95. doi: 10.1109/MCSE.2007.55

25. Васком М., Ботвинник О., Остблом Дж. и соавт. mwaskom/seaborn: v0.10.1 (апрель 2020 г.). Зенодо. 2020.

26. Уикхэм Х. Ggplot2: элегантная графика для анализа данных. Нью-Йорк: Springer-Verlag; 2016.

27. Каракаузи М., Пиовесан А., Антонарос Ф., Стрипполи П., Витале Л., Пеллери М.С. Систематическая идентификация генов домашнего хозяйства человека, возможно, полезна в качестве ссылок в исследованиях экспрессии генов. Мол Мед Респ. 2017;16(3):2397–2410. дои: 10.3892/ммр.2017.6944

28. Гаттаццо Ф., Урчуоло А., Бональдо П. Внеклеточный матрикс: динамическая микросреда для ниши стволовых клеток. Биохим Биофиз Акта. 2014;1840(8):2506–2519. doi:10.1016/j.bbagen.2014.01.010

29. Налланхайгал С., Хейзерман Дж. П., Чхон Д. Роль внеклеточного матрикса в стволовости рака. Front Cell Dev Биол. 2019;7:86. doi: 10.3389/fcell.2019.00086

30. Чен С., Чжао С., Карнад А., Фриман Дж.В. Биология и роль CD44 в развитии рака: терапевтические последствия. J Гематол Онкол. 2018;11(1):64. дои: 10.1186/s13045-018-0605-5

31. Лю М., Го С., Стайлз Дж. К. Новая роль CXCL10 в развитии рака (обзор). Онкол Летт. 2011;2(4):583–589. doi: 10.3892/ol.2011.300

32. Рау А., Маро Г., Джафрезик Ф. Дифференциальный метаанализ данных секвенирования РНК из нескольких исследований. БМК Биоинформ. 2014;15:91. дои: 10.1186/1471-2105-15-91

33. Накамура Х., Фуджи К., Гупта В. и др. Идентификация ключевых модулей и узловых генов для мелкоклеточной карциномы легкого и крупноклеточной нейроэндокринной карциномы легкого с помощью анализа взвешенной сети коэкспрессии генов клинических тканевых протеомов. PLoS Один. 2019;14(6):e0217105. doi:10.1371/journal.pone.0217105

34. Nabet BY, Qiu Y, Shabason JE, et al. Неэкранирование экзосомной РНК связывает активацию стромы с передачей сигналов рецептора распознавания образов при раке. Клетка. 2017;170(2):352–366.e313. doi:10.1016/j.cell.2017.06.031

35. Van Puyenbroeck V, Vermeire K. Ингибиторы транслокации белков через мембраны секреторного пути: новые противомикробные и противораковые средства. Cell Mol Life Sci. 2018;75(9):1541–1558. дои: 10.1007/s00018-017-2743-2

36. Нио К., Ямасита Т., Канеко С. Развивающаяся концепция стволовых клеток рака печени. Мол Рак. 2017;16(1):4. дои: 10.1186/s12943-016-0572-9